大样本用户案例Cell Rep：600例转录组揭示禁食激活蛋白酶体开关| 转录调控专题

文章标题：Circadian transcriptional pathway atlas highlights a proteasome switch in intermittent fasting

刊登日期：2022年10月

发表期刊：Cell Reports

影响因子：9.995

技术手段：转录组测序（联川生物提供）

摘要

虽然间歇性禁食是一种有益于健康的策略，但尚不清楚体内是否存在一种“计时器”来记录禁食持续时间并触发转录水平切换的开关。
本文中，来自湖南师范大学的李国林教授团队利用600个小鼠样本的转录组测序数据，绘制了5种进食模式（自由进食和间歇性禁食的四种不同形式）下小鼠4种主要代谢组织（肝脏、肌肉、白色脂肪、棕色脂肪）在24小时内的6个时间点的时空转录组图谱，为系统揭示间歇性禁食改善健康的时空机制奠定了坚实基础。
结果表明，超过96%经典组织特异性通路具有24小时节律性，并且其节律特征很容易受不同进食模式的影响。而其中只有不到25%的通路会引起转录功能的变化。禁食16小时会引发肝脏中43条通路的昼夜节律发生转换，并且这种切换一旦开始，其波谷和波峰将在随后的再进食和禁食中准时出现。有趣的是，这些通路的所有共享基因都是编码蛋白酶体亚基的基因，表明蛋白酶体基因显示出16小时禁食依赖性转录开关。

5种进食模式缩写：

随意进食(AL)、急性禁食(AF)、急性禁食后重新喂食(AR)、隔日禁食后重新喂食(EODF)、隔日再喂食 (EODR)

1. 间歇性禁食引起小鼠的通路切换具有组织特异性

作者首先分析了EODF组（隔日禁食）和AL组（随意进食）的体重后发现，EODF组的小鼠体重出现降低。

紧接着作者采用大规模转录组测序的方式对取样组织进行检测。总计7个时间点包含各个组织，每组生物学重复数量为5只小鼠，总计600例样本。

作者对AL（随意进食）、AF（急性禁食）、AR（急性禁食后喂食）、EODF（隔日禁食）、EODR（隔日禁食后喂食）的小鼠中的肝脏组织、骨骼肌、棕色脂肪（BAT）、白色脂肪（WAT）每间隔4小时取样，并进行转录组测序。组内生物学重复Spearman系数高达0.95，组间样本Spearman系数也超过0.8。

PCA分析并未能够区分不同喂养禁食方式在不同组别之间有明显区别，因此作者推测从不同时间维度来寻找间歇性禁食的特异性基因可能无法实现。

紧接着采用GSVA打分的方式对不同组别（时间维度和组织维度的分组）进行分析后发现，超过74%的通路在四个大的组别中显著富集。进一步通过PCA进行分组后发现，仍然有超过一半的富集通路有重叠。超过一半的核受体及蛋白质编码基因表达呈现一定的节律性规律。而喂食方式对富集通路影响可能会被这些所谓特征基因所呈现的差异性所覆盖。

如先前预期，作者发现了组织特异性以及不同喂食特异性的基因呈现出典型的昼夜节律特征。AL组小鼠的骨骼肌中有8%的通路出现显著的昼夜节律差异，而其他组织有超过25%。这个结论与先前已发表的研究一致。

与AL组相比，其他组别的禁食喂食方式均降低了肝脏和白色脂肪中昼夜节律相关通路表达，但是骨骼肌和棕色脂肪组织中这些通路仅在特定喂食方式中出现下降。因此不同喂食方案对通路影响呈现组织特异性。

AL组和AF组中的肝脏和骨骼肌昼夜节律通路相关性较低，几乎无重叠。

此外AF组小鼠在不同时间阶段不同组织中高表达也呈现一定的规律性。白色脂肪在禁食后8-10h对应节律通路基因表达达到峰值，棕色脂肪在12h，肝脏为20h，骨骼肌为22h。这表明间歇性禁食可以以组织特异性方式轮番在不通过组织中出现。

2. 全天候经典通路分析表明间歇性禁食对急性禁食后喂食组的适应性

为了消除昼夜节律本身对基因表达的影响，作者将不同时间点的基因表达取平均值Ed后进行PCA、GSVA及Spearman相关性分析。最后发现，不同喂养方式会导致基因表达及相应经典通路出现改变。

AF组（急性禁食）和EODR组（隔日禁食后喂食），或AR组（急性禁食后喂食）和EODF（隔日禁食）组的Spearman相关性系数明显呈现负相关。这个分析结果，挑战了传统观点即AF和AR，或EODF和EODR才是负相关。

结果表明，急性禁食后喂食可能是一种营养学上的挑战，而间歇性禁食通过适应挑战，可能会对身体产生有益的影响。

3. 16小时禁食或再喂食，功能性节律通路在肝脏中出现明显转换

作者对不同时间段的通路中表达基因进行GSVA打分，并对GSVA打分本身进行差异分析，检测到1343个差异通路DEP。其中有16.6%-24.9%为节律相关通路，并命名为FRP。

其中作者从肝脏热图中发现16h处禁食或再喂食都显示通路表达趋势的显著转换。而其他组织或AL的肝脏中却没发现这种表达情况。这说明体内有一个肝脏特异性的“计时器”来记录禁食和再喂食的持续时间。

因此作者进一步分析每个组织内节律相关通路FRP在喂养上的特异性和组织分布，FRP分为AL和AF组。由于仅在AL小鼠中出现的节律变换通路实际上代表了AF期间失去节律性且无法在其他喂养方案中恢复节律性的通路，它也反映了AF的影响。这些数据表明，大多数重叠的通路可能直接源于AF诱导的昼夜节律波动或间接源于对AF诱导的昼夜节律波动的适应。

FRP在EODF和EODR的比例有所增加，而AF的比例减少，表明间歇性禁食引起的转录功能变化更多来自适应AF引起的昼夜节律波动。但奇怪的是，16h峰值并未出现，而FRP的峰值则由于不同喂养方式不同而有所差异。

然而作者注意到在同一节律震荡变化时间点在不同组织的DEP中，AR和EODF组之间出现了几对经典的反向效应（上图中的绿色剪头），这些对大多发生在AF小鼠的FRP中。

AF小鼠中FRP的组织分布突出了禁食在肝脏中的时间效应，因为只有肝脏在禁食第20h的单个时间点迅速达到峰值。

作者继续分析AR组小鼠上调的45个通路以及EODF小鼠中下调的57个通路，发现共有43条通路取交集，且占据肝脏229个节律通路中的18.8%。这43条通路显示出强烈的典型的昼夜节律共振规律。

虽然AF小鼠在禁食20h达到峰值，但几乎所有通路在禁食16h明显切换。这43条通路仅在禁食或再喂食小鼠中有节律震荡规律，而在AL小鼠中则没有。

此外，在不同的喂养方案中，转换时间固定在禁食或再喂养的第16小时。因此，这些数据证实了作者的假设——即间歇性禁食可能会触发整体通路水平的上基因表达水平转换。

4. 肝脏中43条昼夜节律通路揭开间歇性禁食中蛋白酶体开关

作者继续探究43条昼夜节律通路一些规律，利用Reactome数据库（详情点击：通路富集分析神器：Reactome数据库简介 | 转录调控专题）注释信息对这43个通路进行分类。虽然42%通路隶属于信号传导，但这些通路的功能主要分布在几个不同的大类别中，包括细胞循环、免疫系统、代谢等。

这些通路中的837个基因，总共有14个基因均在43个通路中表达。令人惊讶的是，这14个基因都是编码蛋白酶体亚基的基因。

这意味着蛋白酶体可能参与协调昼夜节律共振。肝脏中蛋白酶体相关基因确实是在禁食或再喂食的时间点发生了显著改变外，而其他组织中相关基因和蛋白并未发生改变。随后作者随机挑选了Psma4、Psmb3和Psmb6分别检测其在RNA转录水平和蛋白水平的表达趋势，基本上趋势一致。

剩下的一个问题是转录转换的时间点是禁食（再喂食）造成的，还是暗/光转周期切换加上禁食（再喂食）的综合效应造成的？

先前一项独立发表额研究中，在六个开始时间点禁食六组小鼠，每组之间间隔4小时。一天内每4小时被杀死的老鼠都被禁食24小时。

这些小鼠中编码蛋白酶体亚基的基因在zeitgeber（授时因子/环境钟）时间4小时或肝脏中的其他时间段没有显示出明显的转录转换。然而禁食诱导的肌肉中某些基因的转录变化，出现类似的节律转换特征，表明禁食的组织特异性作用。总之，这些数据表明，正是16小时的禁食启动了肝脏中编码蛋白酶体亚基的基因的转录切换。

此外作者分析了不同组间血清酮体的振荡规律。结果表明，禁食增加了血清乙酰乙酸和β-羟基丁酸水，但在禁食期间没有表现出明显的波动。这些证据表明，蛋白酶体才是禁食计时器，而不是酮信号。

写在文末与部分感想

在这篇研究中，湖南师范大学李国林教授团队非常精彩的应用了多种分析组合工具来证明了肝脏蛋白酶体是禁食时长的计时器，禁食16小时能脉冲式地激活蛋白酶体和诱导诸多经典通路发生节律性共振，间歇性禁食通过改善细胞质量控制系统的功能而改善健康。

初步看到这篇文章的老师们可能会觉得正文中的图片和分析不是特别多，认为分析结果也比较简单。事实上，在不断探索各类分析组合工具的时候，李国林教授团队还是遇到了不少的挑战。

根据李国林教授本人以及联川生物内部的若干位生信同事反馈，面对这600个样本组成的庞大数据集，李国林教授团队据悉曾尝试了各种分析方法、算法和生信工具。

从分析上思路上，要证明基因表达是否有组织特异性，以及时空表达特异性。若从基因的角度出发很有可能会出现大量差异基因，而这些差异基因往往代表真实的调控主次作用，极有可能出现高表达的差异基因并非是主效基因。若从家族基因、转录因子以及其他某些相似基因集的角度出发也有可能会出现阴性或无差异结果的情况。

所以在这篇研究中，采用GSVA打分以及把通路作为整个单元进行分析，与其说是创新的结果，不如说是尝尽各种方法后比较可行的一种路径。并在后期将节律相关通路定义为FRP。

这种以整个通路及基因集打分的方式，与单细胞测序中采用AUCell或AddModuleScore包对细胞亚群进行定义打分有着异曲同工之妙（详情请点击：单细胞+miRNA联合分析发10分Cell子刊是因为做了这个分析 | 转录调控专题）。因为单个基因或者几个基因无法行使主要功能，这个时候往往是以通路上的基因集或者多个通路的一大群基因集来起作用。

采用PCA及Spearman的方式对样本聚类情况进行分析，也可以在前期初步甄别某组样本是否存在组内或组间相似性。进一步可将某一类基因表达或者多组基因表达进行归一化或者平均化处理后，进行Spearman聚类以及GSVA打分。这种方式与动植物群体研究三板斧中的PCA也有着相似的思路。

时序分析既可以是单个基因表达为载体，也可以是GSVA打分，也可以是基因表达平均值/归一化值。这就为后期大样本的数据分析打开了一种新的思路。

为李国林教授团队所有成员的坚忍不拔点赞。也希望大家在看到这篇研究后有所启发，后期在数据分析的方法上能够打开思路，多做尝试多做创新。

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